Trong hỗ trợ sinh sản hiện đại, mục tiêu không chỉ là tạo được phôi và chuyển phôi thành công mà còn là lựa chọn phôi có nguy cơ di truyền thấp nhất. Đặc biệt đối với những gia đình đã biết có bệnh lý di truyền đơn gen trong gia đình.
Nội dung của bài trình bày của ThS Lê Ngọc Yến sẽ tập trung vào ý nghĩa của PGT-M, nguyên lý phân tích, các trường hợp chỉ định, yêu cầu thu mẫu, quy trình thiết lập xét nghiệm cũng như vai trò của tư vấn di truyền trong việc đồng hành cùng bác sĩ và gia đình trước mỗi chu kỳ IVF. Hy vọng thông qua phần trình bày này, quý vị sẽ có cái nhìn rõ hơn về cách PGT-M được thiết kế riêng cho từng gia đình nhằm hỗ trợ lựa chọn phôi phù hợp và giảm nguy cơ sinh con mắc bệnh di truyền nghiêm trọng.
Bài trình bày bao gồm các nội dung:
| I) Tổng quan về bệnh lý đơn gen và nhu cầu chỉ định PGT-M |
| 2) Quy trình thực hiện PGT-M |
| 3) Ưu điểm của PGT-M tại Genome |
I. Tổng quan về bệnh lý đơn gen và nhu cầu chỉ định PGT-M
1. Bệnh lý di truyền đơn gen là gì?
Trước khi đi vào chi tiết PGT-M là gì thì chúng ta cần hiểu rõ nhóm bệnh lý mà xét nghiệm này hướng tới đó là các bệnh di truyền đơn gen.
Bệnh lý di truyền đơn gen là các rối loạn di truyền gây ra bởi một hoặc nhiều biến thể gây bệnh nằm trên cùng một gen. Mặc dù chỉ liên quan đến một gen, tuy nhiên về biểu hiện lâm sàng của các bệnh này thì rất đa dạng và phức tạp. Nhiều trường hợp có triệu chứng liên quan đến nhiều chuyên khoa khác nhau như: Huyết học, thần kinh, cơ xương khớp, chuyển hóa hoặc miễn dịch.
Hiện nay thì đã có hơn 7000 bệnh di truyền đơn gen đã được ghi nhận trong các cơ sở dữ liệu di truyền học ở người. Tuy nhiên, việc chẩn đoán xác định không phải lúc nào cũng đơn giản. Một số bệnh có phổ biến thể rất rộng, một số bệnh có thể do nhiều dạng tổn thương khác nhau gây ra. VD: Biến thể dạng đột biến điểm, đột biến mất đoạn, lặp đoạn, các biến thể dạng đồng hợp tử, dị hợp tử hoặc dị hợp tử phức hợp.
Chính vì vậy trong thực hành lâm sàng, thách thức đầu tiên không phải là chỉ định PGT-M mà là phải xác định được chính xác tổn thương di truyền gây bệnh trong gia đình. Đây sẽ là cơ sở quan trọng để lựa chọn phương pháp xét nghiệm phù hợp, tư vấn nguy cơ tái phát và thiết kế quy trình PGT-M cho từng gia đình cụ thể.
2. Mức độ ảnh hưởng của nhóm bệnh di truyền đơn gen
2.1. Nguy cơ sức khỏe
Các rối loạn di truyền theo quy luật Menđen là một trong những nguyên nhân quan trọng gây bệnh nặng ở trẻ em. Trong các số liệu được ghi nhận, nhóm bệnh này chiếm khoảng 20% tỷ lệ tử vong ở trẻ sơ sinh và khoảng 10% các ca nhập viện ở trẻ em.
Điều này cho thấy bệnh đơn gen không chỉ là vấn đề di truyền hiếm gặp mà có thể tạo ra gánh nặng đáng kể cho gia đình và hệ thống y tế.
2.2. Nguy cơ sinh sản và sinh con mắc bệnh
Bên cạnh đó, bệnh đơn gen còn liên quan trực tiếp đến nguy cơ sinh sản.
Mỗi cá thể trong dân số mang trung bình khoảng 2,8 biến thể gây bệnh. Đặc biệt có khoảng 24% cá thể là người mang gen của ít nhất một bệnh di truyền lặn đơn gen và một tỉ lệ nhỏ hơn có thể đồng thời mang gen của nhiều bệnh lý khác nhau. Như vậy thì trong hỗ trợ sinh sản, việc nhận diện các cặp vợ chồng có nguy cơ mang biến thể gây bệnh là rất quan trọng, vì những cặp vợ chồng này sẽ có nguy cơ sinh con bị bệnh. Đây chính là cơ sở để tư vấn di truyền, chỉ định xét nghiệm phù hợp và cân nhắc thực hiện PGT-M nhằm giảm nguy cơ sinh con mắc bệnh di truyền nghiêm trọng.
Nhu cầu chỉ định PGT-M
Sau khi đã xác định được một cặp vợ chồng có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh di truyền đơn gen, bước tiếp theo rất quan trọng là thực hành tư vấn di truyền. Mục tiêu của tư vấn không chỉ là giải thích kết quả xét nghiệm hay tình trạng mang gen mà còn giúp cặp vợ chồng hiểu rõ nguy cơ sinh con mắc bệnh, khả năng di truyền có các thế hệ sau cũng như là các lựa chọn sinh sản của cặp vợ chồng có thể có.
Theo các khuyến nghị thực hành, những cặp vợ chồng có nguy cơ cao thì nên được tư vấn bởi bác sĩ và chuyên gia di truyền để lựa chọn phương án phù hợp với hoàn cảnh của gia đình.
Các lựa chọn có thể bao gồm như là thực hiện IVF kết hợp xét nghiệm PGT-M, sử dụng trứng hoặc tinh trùng hiến tặng hoặc là phương pháp nhận con nuôi.
Trong đó, IVF kết hợp xét nghiệm di truyền tiền làm tổ cho bệnh lý đơn gen là giải pháp cho phép đánh giá tình trạng di truyền của phôi trước khi chuyển phôi, từ đó hỗ trợ lựa chọn phôi không mắc bệnh lý di truyền đang được khảo sát. Đây là một hướng tiếp cận chủ động giúp giảm nguy cơ sinh con mắc bệnh đơn gen nghiêm trọng trong các gia đình đã xác định được biến thể gây bệnh.
Giải pháp PGT-M trong hỗ trợ sinh sản
Thông qua IVF thì phôi sẽ được tạo ra và sinh thiết ở giai đoạn phù hợp. Thường là sẽ phôi ở ngày 5 hoặc ngày 6. Sau đó, phòng xét nghiệm sẽ phân tích tình trạng di truyền của từng phôi nhằm hỗ trợ lựa chọn các phôi không mắc bệnh lý di truyền đang khảo sát để ưu tiên chuyển phôi.
Phạm vi xét nghiệm của xét nghiệm PGT-M sẽ bao gồm nhiều nhóm bệnh lý đơn gen khác nhau. Ví dụ như là Thalassemia, hemophilia, teo cơ tủy, loạn dưỡng cơ Duchenne và các bệnh lý đơn gen khác. Ngoài ra thì trong một số trường hợp đặc biệt, xét nghiệm có thể kết hợp đánh giá tương thích HLA nhằm lựa chọn phôi vừa không mắc bệnh di truyền đơn gen, vừa có khả năng phù hợp HLA với người anh hoặc người chị bị bệnh để hỗ trợ định hướng ghép tế bào gốc sau sinh.
Đối tượng chỉ định PGT-M
Về đối tượng chỉ định của xét nghiệm PGT-M là các cặp vợ chồng đã xác định có tổn thương di chuyển đơn gen trong gia đình bao gồm các bệnh di truyền trội, di truyền lặn, di chuyển liên kết nhiễm thể, các hội chứng lạc bộ ba nucleotype hoặc các mất thêm base trên gen.
Như vậy thì PGT-M không chỉ là xét nghiệm trên phôi mà là một quy trình phối hợp giữa hỗ trợ sinh sản, xét nghiệm di truyền và tư vấn di truyền nhằm giúp gia đình có thêm cơ hội sinh con khỏe mạnh và giảm nguy cơ lặp lại bệnh lý di truyền nghiêm trọng.
II) Quy trình thực hiện PGT-M
Các bước chính trong quy trình IVF sẽ kết hợp với PGT-M sẽ gồm một số các bước chính sau.
Quy trình IVF kết hợp PGT-M
PGT-M Set up là bước thiết lập tiền lâm sàng. Mục tiêu của giai đoạn này sẽ là thiết lập xét nghiệm tiền lâm sàng phục vụ chẩn đoán bệnh đơn gen trên phôi có thể kết hợp với đánh giá tương tích HLA trong một số trường hợp thì kết quả của giai đoạn này sẽ là xây dựng được bộ haplotype gia đình dựa trên các cơ là STR và SNP liên kết với lại vùng tổn thương.
Loại mẫu: Mẫu máu của các cặp vợ chồng và các thành viên liên quan trong gia đình, ưu tiên mẫu gia đình 2 đời.
Thời gian thực hiện khoảng từ 1 đến 3 tháng tùy theo dạng bệnh lý và dạng tổn thương di truyền và mức độ đầy đủ các loại mẫu trong gia đình.
Sau khi set up thành công PGT-M, quy trình IVF tiếp tục diễn ra với mục tiêu: Tạo phôi trong ống nghiệm để phục vụ sinh thiết và xét nghiệm PGT-M. Các bước chính bao gồm:
| 1) Kích thích buồng trứng | 2) Chọc hút noãn |
| 3) Lấy tinh trùng thụ tinh trong ống nghiệm | 4) Nuôi cấy phôi và sinh thiết phôi ở giai đoạn phù hợp. Phôi sau khi sinh thiết sẽ được chuyển tới TTXN để tiến hành các bước tiếp theo là PGT-M chẩn đoán trên phôi. |
PGT-M chẩn đoán trên phôi với mục tiêu phân tích tình trạng di truyền của từng phôi đối với bệnh lý đơn gen đã được thiết lập ở giai đoạn PGT-M setup. Có thể kết hợp đánh giá HLA nếu có chỉ định.
Loại mẫu: Sinh thiết tế bào phôi ngày 3 hoặc ngày 5 tùy theo quy trình IVF và các giai đoạn phát triển của phôi. Thời gian trả kết quả khoảng 12 ngày sau khi phòng xét nghiệm nhận đủ mẫu sinh thiết phôi và đạt yêu cầu.
Nguyên nhân gây sai trong PGT-M
Xét nghiệm PGT-M được thực hiện trên mẫu sinh thiết từ phôi, thường có đặc điểm là chỉ từ một lượng tế bào rất nhỏ: Khoảng 1-10 tế bào. Điều này khác biệt hoàn toàn so với các xét nghiệm di truyền được thực hiện trên mẫu máu ngoại vi khi mà lượng DNA đổ vào của mẫu máu thường dồi dào và ổn định.
Do lượng vật chất di truyền ban đầu rất hạn chế, chỉ từ rất ít tế bào, do đó quy trình xét nghiệm PGT nói chung và PGT-M nói riêng thì đều bắt buộc phải có bước khuếch đại toàn bộ hệ gen hay còn gọi là WGA trước khi thực hiện các phân tích di truyền tiếp theo.
Tuy nhiên, chính bước WGA cũng có thể làm phát sinh một số nguy cơ kỹ thuật ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả, đặc biệt là trong PGT-M. Khác với PGT-A hay PGT-SR, vốn chủ yếu đánh giá bất thường ở mức nhiễm sắc thể hoặc là đoạn nhiễm sắc thể thì PGT-M sẽ tập trung phân tích biến thể ở mức gen hoặc alen. Vì vậy các sai lệch nhỏ trong quá trình khuếch đại DNA cũng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến việc phân loại tình trạng di chuyển của phôi.
Nguy cơ kỹ thuật
Trong đấy thì có ba nguy cơ kỹ thuật hay được đề cập nhất:
1) Mất allen hay còn gọi là Allele Dropout – Đây là hiện tượng mà một trong hai alen tại vị trí khảo sát không được khuếch đại hoặc khuếch đại không đủ trong quá trình WGA, thì hậu quả là tín hiệu của alen đó bị mất trên kết quả phân tích.
Điều này đặc biệt nguy hiểm trong các trường hợp phôi mang kiểu gen dị hợp vì có thể làm phôi dị hợp bị diễn giải nhầm thành đồng hợp bình thường hoặc là đồng hợp mang biến thể.
2) Ngoại nhiễm DNA. Do mẫu đồ vào chỉ gồm là rất ít tế bào, chính vì vậy chỉ cần nhiễm thêm một lượng nhỏ DNA ngoại lai. Ví dụ như là các tế bào từ mẹ hoặc DNA từ người thao tác hoặc là DNA từ các mẫu khác cũng có thể làm sai lệch kết quả phân tích. Nguy cơ này thì có thể xảy ra trong quá trình sinh thiết, chuyển mẫu, ly giải tế bào hoặc là thực hiện WGA.
3) Khuếch đại không đồng đều hoặc thất bại khuếch đại vùng đích. Trong WGA, không phải mọi vùng trên hệ gen đều được khuếch đại với hiệu suất như nhau. Một số vùng được khuếch đại quá mức, trong khi một số vùng khác khuếch đại kém hoặc không khuếch đại. => Điều này có thể làm giảm chất lượng tín hiệu và gây khó khăn trong việc đọc kiểu gen, xác định Marker liên kết hoặc phát hiện biến thể gây bệnh.
=> Chính vì vậy, trong PGT-M, kết quả không chỉ dựa vào phân tích trực tiếp tại vị trí biến thể mà còn kết hợp thêm phân tích di truyền liên kết bằng các marker ST hoặc SNP bao quanh ở vùng gen bệnh để kiểm soát các nguy cơ kỹ thuật như ADO, ngoại nhiễm hoặc sai lệch khuếch đại. Từ đó, giúp nâng cao độ tin cậy của các kết quả chẩn đoán trên phôi.
ADO gây sai trong PGT-M như thế nào?
Bệnh di truyền gen lặn
AO hay là gọi là mất allen là hiện tượng mà một trong hai alen không được khuếch đại hoặc khuếch đại không đủ. Khi đó tín hiệu thu được sau phân tích không còn phản ánh đúng kiểu gen thực tế của phôi. Và nguy cơ này đặc biệt quan trọng trong các trường hợp phôi có kiểu gen dị hợp tử.
VD: Trong trường hợp bệnh di truyền lặn, một phôi thực tế có kiểu gen dị hợp tử gồm một alen bình thường và một alen mang biến thể là một alen bị bệnh. Về bản chất đây là phôi mang gen bệnh nhưng mà có thể sẽ không mắc bệnh. Tuy nhiên nếu ADO xảy ra trong quá trình khuếch đại DNA có thể xuất hiện hai tình huống sai lệch.
+) Trường hợp thứ nhất, nếu Alen bình thường bị mất tín hiệu, khi đó kết quả phân tích chỉ còn ghi nhận Alen bị bệnh và làm phôi từ dị hợp tử bị diễn giải nhầm thành đồng hợp mang biến thể gây bệnh. Phôi có thể bị phân loại sai là phôi mắc bệnh và không được ưu tiên chuyển, mặc dù thực tế chỉ là phôi mang gen.
+) Trường hợp thứ hai là alen mang biến thể bị mất tín hiệu. Khi đó kết quả phân tích chỉ còn ghi nhận alen bình thường làm phôi dị hợp tử bị diễn giải nhầm thành đồng hợp. Phôi có thể được kết luận sai là không mang biến thể gây bệnh trong khi thực tế phôi vẫn mang gen và có khả năng truyền alen bệnh cho thế hệ sau.
=> Như vậy cùng một phôi dị hợp tử nhưng tùy alen nào bị mất tín hiệu trong quá trình WGA, kết quả có thể bị sai lệch theo hai hướng khác nhau hoặc là đánh giá quá mức nguy cơ hoặc là bỏ sót tình trạng mang gen. Và nguy cơ này còn nguy hiểm hơn nếu bệnh là di truyền trội. Trường hợp khi mà phôi dị hợp tử mang gen sẽ biểu hiện thành bệnh tuy nhiên lại được đánh giá là phôi không bị bệnh. Đây cũng là các lý do PGT-M không nên chỉ dựa vào phân tích trực tiếp tại vị trí biến thể mà cần kết hợp phân tích di truyền liên kết hoặc bằng các STR hoặc SNP để kiểm soát nguy cơ ADO.
Khuyến cáo từ Hiệp hội Sinh sản và Phôi học Châu Âu (ESHRE)
Theo như thống kê thì tỉ lệ có thể phát sinh từ 10 đến 30%. Như vậy thì đây là một cái nguy cơ rất lớn gây sai trong PGT-M nếu chúng ta chỉ nhìn kết quả trên phân tích trực tiếp.
Trong xét nghiệm PGT-M thì việc kết hợp giữa phát hiện trực tiếp biến thể gây bệnh và phân tích gián tiếp thông qua các di truyền liên kết được xem là cách tiếp cận tối ưu và thường được coi là tiêu chuẩn vàng trong thực hành. Phân tích liên kết không chỉ giúp củng cố kết quả chẩn đoán khi đánh giá biến thể gây bệnh mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong việc kiểm soát các nguy cơ kỹ thuật đặc thù của PGT-M như đã trình bày ở slide trước.
Ví dụ như là tình trạng ngoại nhiễm hoặc là tái tổ hợp di truyền. Đây đều là những yếu tố có thể làm sai lệch kết quả phân tích. => Vì vậy, nếu không được nhận diện và kiểm soát tốt, chúng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến độ tin cậy của kết quả chẩn đoán trên phôi.
Sau khi đã xác định được vai trò của phân tích liên kết trong PGT-M, điểm quan trọng tiếp theo là phải hiểu được cách phân tích này được thực hiện.
Về nguyên tắc thì chúng ta sẽ không chỉ nhìn vào một điểm biến thể gây bệnh mà sẽ theo dõi cả một vùng di truyền trước và sau biến thể đó trong gia đình thông qua việc sử dụng các marker đa hình như là SNP hoặc là STR nằm gần gen bệnh.Qua bước này thì phòng xét nghiệm có thể xây dựng được haplotype của bố và mẹ và xác định được haplotype nào liên quan đến alen bệnh và haplotype nào liên quan đến alen bình thường.
Khi phân tích trên phôi, nếu phôi mang haplotype liên kết với alen bệnh, phôi sẽ được đánh giá là có nguy cơ mang hoặc mắc bệnh tùy theo kiểu di truyền của bệnh lý là di truyền trội hay di truyền lặn. Ngược lại nếu phôi mang haplotype liên kết với alen bình thường phôi có thể được phân loại là không mang biến thể bệnh tương ứng.
Cách tiếp cận này giúp kết quả PTTM không phụ thuộc vào một tín hiệu đơn lẻ như là xét nghiệm trực tiếp sanger trên vị trí biến thể mà dựa trên cả một mô hình di truyền trong gia đình, từ đó làm tăng độ tin cậy của quy trình phân loại phôi.
Phân tích di truyền liên kết
Về nguyên lý thì phân tích di truyền liên kết trong PGT-M dựa trên khảo sát các marker di truyền đa hình, thường là các STR là các cái lặp liên tiếp ở trong hệ gen cũng như là các SNP là các đa hình đơn nucleotide. Các STR và SNP theo quy ước phải nằm trước và sau vị trí tổn thương trong khoảng từ 1 đến 2 Mb thì việc nằm ở lân cận và bao quanh vị trí biến thể gây bệnh giúp cho chúng có xu hướng được di truyền liên kết với nhau.
Các STR, SNP sẽ di truyền cùng với các alen bệnh hoặc các alen bình thường qua các thế hệ tạo thành các cái haplotype đặc trưng trong gia đình.
Trong giai đoạn đầu tiên là giai đoạn tiền lâm sàng, tiền phân tích PGT-M thì phòng xét nghiệm sẽ tiến hành phân tích DNA của cặp vợ chồng và các thành viên liên quan trong gia đình, chẳng hạn như là người con ruột hoặc là bố mẹ bên vợ hoặc bố mẹ bên chồng.
Mục tiêu của bước này là để xác định pha di truyền, tức là thiết lập cái mối liên kết giữa biến thể gây bệnh với các marker xung quanh. Từ đó xác định haplotype đi kèm với alen mang biến thể và haplotype đi kèm với alen không mang biến thể.
Các haplotype mà di truyền với alen mang biến thể gây bệnh được gọi là haplotype nguy cơ cao. Ngược lại các haplotype mà di truyền với alen không mang biến thể gây bệnh thì được gọi là haplotype nguy cơ thấp.
Sau khi các haplotype trong gia đình đã được thiết lập thì mẫu sinh thiết phôi sẽ được phân tích. Haplotype của từng phôi sẽ được đối chiếu với lại haplotype nguy cơ cao và nguy cơ thấp đã xác định từ trước đó ở giai đoạn PGT-M setup. Từ đó chỉ ra được rằng là phôi đã được di chuyển alen bệnh hay alen bình thường từ bố hoặc mẹ.
Như đã nói ở phía trước, phân tích di truyền liên kết cho phép đánh giá tình trạng di truyền của phôi dựa trên mô hình di truyền của các vùng gen bao quanh biến thể gây bệnh thay vì chỉ phụ thuộc vào tín hiệu tại một vị trí biến thể đơn lẻ thì cái cách tiếp cận này đặc biệt quan trọng trong PGT-M do lượng DNA từ mẫu sinh tiết phôi rất hạn chế và có nguy cơ xảy ra các sai số kỹ thuật như là mất alen ngoại nhiễm hoặc là cái hiện tượng tự nhiên như là tái tổ hợp trao đổi chéo trong nguyên phân và giảm phân.
Tổng quan xét nghiệm PGT-M, PGT-HLA tại Genome
Ý nghĩa xét nghiệm:
PGT-M sẽ giúp chẩn đoán các bất thường di truyền trên phôi trước khi chuyển phôi. Đặc biệt là trong gia đình đã xác định được nguy cơ bệnh lý đơn gen hoặc là bất thường di truyền có tính gia đình.
Mẫu:
Mẫu sinh thiết phôi ngày 3 đến hoặc ngày 5. Và ở bước PGT-M setup sẽ là mẫu máu của các thành viên trong gia đình, thường là tối thiểu hai đời để phục vụ phân tích di chuyển liên kết.
Công nghệ:
Genome kết hợp phát hiện trực tiếp tổn thương bằng các phương pháp trực tiếp như là Sanger hoặc là Mini Sequencing. Đồng thời phân tích gián tiếp thông qua các marker SNP đặc hiệu. Cách tiếp cận này giúp tăng độ tin cậy của kết quả và kiểm soát các nguy cơ kỹ thuật trong PGT-M.
Thời gian:
Genome đang chia làm hai giai đoạn và chia làm hai gói xét nghiệm là G1 và G2.
Với gói PGT-M G1 sẽ áp dụng cho các nhóm bệnh thường gặp với thời gian setup khoảng 30 ngày. PGT-M G2 sẽ áp dụng cho các bệnh đơn gen khác hoặc các trường hợp phức tạp hơn như HLA matching và thời gian setup sẽ khoảng 90 ngày.
Sau khi hoàn tất setup, thời gian phân tích mẫu phôi cho cả hai gói G1 và G2 sẽ là 12 ngày.
Phạm vi xét nghiệm:
Phạm vi xét nghiệm thì không chỉ giới hạn ở các bệnh đã liệt kê như là: Thalassemia, hemophilia, teo cơ tủy và các bệnh đơn gen khác. Về bản chất thì PGT-M là xét nghiệm được thiết kế riêng theo từng tổn thương và từng gia đình. Ngoài ra, Genome cũng triển khai lựa chọn phôi tương thích HLA trong các trường hợp có người thân mắc bệnh cần hỗ trợ điều trị bằng ghép tế bào gốc trong trường hợp gia đình có nhu cầu và được chỉ định.
Quy trình thực hiện PGT-M tại Genome
Quy trình thực hiện PGT-M tại Genome ở giai đoạn thiết lập PGT-M sẽ được phân thành hai gói riêng biệt như đã trình bày ở slide trước. Dựa trên mức độ phổ biến của bệnh lý và kinh nghiệm triển khai cũng như độ phức tạp trong thiết kế xét nghiệm của từng gia đình.
PGT-M Set up
PGT-M setup G1 sẽ áp dụng cho các nhóm bệnh đơn gen thường gặp và đã có quy trình thiết lập tương đối chuẩn hóa bao gồm: Alpha Beta Thalassemia, Hemophilia AB, teo cơ tủy và loạn dưỡng cơ duchenne. Với nhóm này, thời gian thiết lập dự kiến khoảng 1 tháng.
Đối với các bệnh lý di truyền đơn gen khác hoặc các trường hợp có yêu cầu phức tạp hơn thì sẽ sử dụng gói PGT-M setup G2 do cần đánh giá riêng biến thể, vùng gen liên quan và thiết kế các marker liên kết và cấu trúc trong gia đình. Thời gian thiết lập dự kiến khoảng 3 tháng.
=> Việc phân nhóm này giúp chuẩn hóa quy trình tư vấn, thu mẫu và triển khai xét nghiệm, đồng thời giúp bác sĩ và gia đình có kế hoạch phù hợp trước khi bước vào chu kỳ IVF và sinh thiết phôi.
 |
 |
Yêu cầu thu mẫu PGT-M
Sau khi xác định được chỉ định thực hiện PGT-M thì bước tiếp theo sẽ là thu thập mẫu từ các thành viên trong gia đình. Mục đích ở đây để xây dựng phả hệ di truyền và xác định cái haplotype liên kết với đột biến bệnh. Tuy nhiên thì không phải tất cả các trường hợp thì đều cần thu mẫu giống nhau. Điều này sẽ tùy thuộc vào kiểu di truyền mà sẽ có các cái thứ tự ưu tiên của các đối tượng thu mẫu sẽ khác nhau.
Bắt buộc
Trước hết là đối với tất cả các nhóm bệnh thì đối tượng bắt buộc phải thu mẫu là cặp vợ chồng. Đây là nguồn DNA chính để xác định đột biến và xây dựng chiến lược phân tích thiết kế bộ marker phục vụ PGT-M.
Trong trường hợp như là đối với bệnh di truyền trội trên nhiễm thể thường sau khi đã có mẫu của hai vợ chồng.
Ưu tiên thứ nhất
Ưu tiên tiếp theo sẽ là con của cặp vợ chồng, đặc biệt là con mắc bệnh. Nếu không có con mắc bệnh thì có thể sử dụng con khỏe mạnh để hỗ trợ phân tích. Việc có mẫu của con sẽ giúp xác định chính xác sự di truyền của các haplotype mang đột biến từ bố hoặc mẹ sang thế hệ sau.
Ưu tiên thứ 2
Nếu gặp vợ chồng chưa có con thì ưu tiên thứ hai là thu mẫu của bố mẹ người mang gen bệnh. Các mẫu này cũng sẽ giúp xác định nguồn gốc của haplotype bệnh và tăng độ chính xác trong quá trình xây dựng phả hệ.
Ưu tiên thứ 3
Ưu tiên thứ ba là anh chị em ruột của người mang gen bệnh. Trong nhóm này, người mắc bệnh được ưu tiên hơn người khỏe mạnh vì cung cấp nhiều thông tin hơn cho việc truy vết haplotype liên kết với đột biến bệnh. Nhưng mà trong thực tế triển khai PGT-M thì không phải trường hợp nào cũng thu thập được đầy đủ mẫu của các thành viên trong gia đình theo như yêu cầu.
Trường hợp đặc biệt/ không đủ mẫu
Một số trường hợp thì người thân không còn lưu mẫu, không thể liên hệ được hoặc là từ chối tham gia hoặc trong một số trường hợp đột biến là đột biến mới xuất hiện ở chính người vợ hoặc người chồng. Khi đó thì việc xây dựng haplotype bằng phương pháp phả hệ truyền thống sẽ gặp rất là nhiều khó khăn.
*Và để giải quyết tình huống này, nguyên tắc được áp dụng là sử dụng phôi làm mẫu tham chiếu*
Thay vì dựa vào thông tin di truyền từ mẫu máu ở trên mẫu người thân thì chúng ta sẽ khai thác dữ liệu từ các phôi được tạo ra trong chu trình IVF để xác định mối liên kết giữa đột biến bệnh và các marker di truyền xung quanh.
Genome khuyến nghị: Nên có tối thiểu 6 phôi để thực hiện phương pháp này. Số lượng phôi càng nhiều thì khả năng xây dựng haplotype càng chính xác. Nếu số lượng ít hơn sáu phôi thì sẽ có nguy cơ không tìm được kiểu gen của phôi có kiểu gen phù hợp để làm mẫu tham chiếu, từ đó ảnh hưởng đến khả năng phân tích và kết luận kết quả.
Đối với các trường hợp thiếu mẫu người thân hoặc đột biến đều, mẫu bắt buộc vẫn là cặp vợ chồng, bất kể bệnh thuộc nhóm di truyền trội trên NST thường hay là lặn trên NSG thường hay là liên kết NST giới tính X. Tuy nhiên thì ngoài mẫu của hai vợ chồng cần có thêm các phôi mang kiểu gen phù hợp để làm mẫu tham chiếu.
Đối với các bệnh di truyền trội trên NST thường thì cần có ít nhất một phôi dị hợp tử mang đột biến. Đối với các bệnh di truyền lặn trên NST thường cũng cần có ít nhất một phôi dị hợp tử để hỗ trợ xác định haplotype liên kết với biến thể bệnh. Bệnh trên di truyền trên NST giới tính X yêu cầu đặc biệt hơn, cần có ít nhất một phôi dị hợp tử hoặc phôi nam bán hợp tử không mang gen bệnh tùy thuộc vào đặc điểm di truyền đột biến và giới tính phôi.
Như vậy thì trong các trường hợp không thể thu đủ mẫu người thân, việc sử dụng mẫu phôi làm mẫu tham chiếu là giải pháp thay thế. Tuy nhiên cần phải nhấn mạnh rằng là hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào số lượng và sự phân bố kiểu gen của các phôi thu được.
Ngoài ra thì khi thực hiện phương pháp này thì cần tư vấn rất kỹ cho bệnh nhân ngay từ giai đoạn đầu chuẩn bị hồ sơ PGT-M cũng như phải hoàn thiện các phiếu đồng thuận. Bệnh nhân cần phải vận được tư vấn về phạm vi xét nghiệm cũng như các nguy cơ tồn dư còn có thể nếu mà chúng ta thực hiện phân tích ngược lại từ trên mẫu phôi.
Ví dụ về yêu cầu thu mẫu PGT-M
Ở đây thì chúng ta sẽ đi đến ba ví dụ để có thể làm rõ hơn về cái yêu cầu thu mẫu của PGT-M.
VD1: Cặp vợ chồng cùng mang biến thể gây bệnh di truyền lặn và đã có con mắc bệnh thì những lúc này thì yêu cầu thu mẫu sẽ cần thu mẫu của cả gia đình bao gồm bố mẹ và người con để thiết lập phân tích di truyền liên kết trước khi thực hiện xét nghiệm trên phôi.
Ở đây thì mẫu máu của người chồng sẽ dùng để xác định biến thể gây bệnh và xây dựng haplotypetừ phía bố. Ngược lại ở phía mẹ cũng sẽ dùng để xác định biến thể gây bệnh và xây dựng haplotype biến thể ở người mẹ.
Mẫu máu của người con mắc bệnh là mẫu tham chiếu quan trọng giúp xác định haplotype nguy cơ cao liên kết với alen bệnh từ cả bố và mẹ. Và mẫu sinh thiết phôi được sử dụng ở giai đoạn xét nghiệm trên phôi sẽ để đối chiếu haplotypecủa từng phôi với haplotypenguy cơ đã thiết lập ở giai đoạn PGT-M setup. Sau đó thì mẫu sinh thiết phôi sẽ được phân tích nhằm xác định phôi mắc bệnh, phôi mang gen hoặc phôi không mang biến thể gây bệnh.
VD2: Vợ chồng cùng mang biến thể gây bệnh di truyền lặn. Tuy nhiên, chưa có con mắc bệnh để làm mẫu tham chiếu.
Yêu cầu thu mẫu: Mẫu máu của chồng, mẫu máu của vợ, mẫu máu của bố mẹ vợ và bố máu của bố mẹ chồng.
Và sau khi quá trình set up thì sẽ là mẫu sinh thiết phôi. Về mục đích thì do cặp vợ chồng chưa có con mắc bệnh, chính vì vậy nên là chúng ta cần phải thu thêm mẫu bố mẹ hai bên để hỗ trợ xác định nguồn gốc của alen bệnh và thiết lập haplotype nguy cơ cao, haplotype nguy cơ thấp cho từng bên gia đình. Và mẫu của chồng vợ bố mẹ hai bên sẽ được sử dụng trong giai đoạn PGT-M setup để xây dựng bộ haplotype trong gia đình và sau đó thì mới sử dụng cái haplotype này để đánh giá ở trên mẫu sinh thiết phôi.
Và cần có một điểm lưu ý rằng là ngoài việc thu mẫu máu của bố mẹ hai bên, bố mẹ vợ, bố mẹ chồng thì còn phải yêu cầu xét nghiệm tình trạng mang gen, tình trạng mang biến thể gây bệnh mà đang tiến hành khảo sát ở trên các mẫu máu của bố mẹ vợ, bố mẹ chồng.
VD3: Vợ chồng cùng mang biến thể gây bệnh di truyền lặn nhưng mà thiếu mẫu của các thành viên liên quan trong gia đình để hỗ trợ thiết lập haplotype.
Lúc này thì yêu cầu thu mẫu không thể thu được mẫu máu đời thứ hai thì chỉ có mẫu máu của vợ và chồng thôi và mẫu sinh thế phôi. Thì trong trường hợp này khi mà đã thiếu mẫu thành viên gia đình nên được khuyến cáo có số lượng phôi đủ nhiều để hỗ trợ quá trình thiết lập và kiểm chứng haplotype.
Và khuyến cáo này nên phân tích từ sáu phôi trở lên. Trong đó lý tưởng thì sẽ cần có ít nhất một phôi ở trạng thái dị hợp tử biến thể để làm mẫu tham chiếu nội bộ cho quá trình phân tích liên kết. Tuy nhiên thì cần lưu ý với các bác sĩ rằng là số lượng lớn hơn sáu phôi không phải là điều kiện bắt buộc mà là số lượng chúng tôi khuyến cáo nhằm tăng xác suất tìm được phôi có kiểu gen phù hợp để sử dụng là mẫu tham chiếu trong quá trình thiết lập haplotype. Mẫu máu của chồng và người vợ sẽ được sử dụng để xác định các biến thể gây bệnh và các marker liên kết. Và mẫu sinh thiết phôi sẽ được phân tích để hỗ trợ. Từ đó chỉ ra rằng là phôi nào là phôi mang haplotype nguy cơ cao và phôi nào là phôi mang haplotype nguy cơ thấp. Từ đó phân tích phân loại tình trạng di truyền của từng phôi. Và trong trường hợp này thì sẽ sử dụng phôi dị hợp tử sẽ là phôi tham chiếu tương ứng như là người con mang dị hợp từ kiểu gen.
III) Ưu điểm của xét nghiệm PGT-M tại Genome
Chứng nhận ngoại kiểm châu Âu – GenQA
Một trong những chương trình ngoại kiểm mà Genome thực hiện hàng năm đấy là chứng nhận ngoại kiểm của châu Âu GenQA.
Về quy trình ngoại kiểm của GenQA sẽ được thiết kế để mô phỏng như một cái quy trình xét nghiệm thực tế trong phòng xét nghiệm. Mẫu sẽ được gửi đến Trung tâm xét nghiệm Genome dưới dạng là mẫu mù. Điều này nghĩa là các mẫu đã được đơn vị ngoại kiểm kiểm nghiệm và được xác định trước kết quả. Tuy nhiên phòng xét nghiệm thì không được biết thông tin này trong quá trình thực hiện. Việc cơ bản thì quy trình thực hiện sẽ tuân thủ như mẫu thông thường của bệnh nhân.
Đầu tiên thì phòng xét nghiệm sẽ nhận mẫu mù từ đơn vị ngoại kiểm. Sau đó thì tiến hành xử lý, phân tích và trả kết quả theo đúng quy trình nội bộ đang được áp dụng trong thực hành thường quy. Cuối cùng thì báo cáo kết quả sẽ được gửi lại cho đơn vị ngoại kiểm để đánh giá về mức độ chính xác và phù hợp của kết quả xét nghiệm.
Tuy nhiên thì ở trên phiếu trả kết quả xét nghiệm thì sẽ được đánh giá dựa trên ba nhóm tiêu chí chính.
Thứ nhất là về genotyping, tức là kết quả được trả ra là chính xác với kiểu gen hoặc tình trạng mang biến thể của các mẫu phôi.
Thứ hai là cái interpretation nghĩa là kết quả đã được diễn giải, phù hợp sử dụng đúng danh pháp và các tiêu chuẩn quốc tế.
Và phần thứ ba nghĩa là các cái hình thức của báo cáo sẽ không được mắc các lỗi hành chính như là sai thông tin mẫu, sai chính tả, sai định dạng hoặc là các lỗi trình bày.
Các hạng mục này thì được chấm với điểm tối đa là hai điểm và do đó kết quả ngoại kiểm thì không chỉ phản ánh cái năng lực phân tích kỹ thuật của phòng xét nghiệm mà còn đánh giá cả về chất lượng diễn giải và độ chính xác của báo cáo kết quả.
Và trung tâm xét nghiệm Genome thì rất vinh dự đạt chứng nhận ngoài kiểm GenQA của châu Âu cho xét nghiệm PGT-M. Đây là minh chứng khẳng định chất lượng xét nghiệm, đảm bảo kết quả với độ chính xác và độ tin kệ cao khi gửi đến các bác sĩ và bệnh nhân.
Bên cạnh đó thì các xét nghiệm di truyền và các hoạt động tư vấn di truyền của Genome cung cấp cũng được xây dựng và triển khai trên cơ sở tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn thực hành lâm sàng của các tổ chức y khoa uy tín trên thế giới.
Quy trình chuyên môn luôn có sự đồng hành và tham vấn từ các chuyên gia di truyền, chuyên gia lâm sàng đầu ngành với nhiều năm kinh nghiệm trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản để nhằm đảm bảo kết quả xét nghiệm được diễn giải chính xác, phù hợp và có giá trị trong định hướng lâm sàng cho từng trường hợp cụ thể.
Một số bệnh lý đơn gen đã được triển khai xét nghiệm PGT-M trong thực tế tại Genome
Tuy nhiên thì cũng cần lưu ý: PGT-M không phải là một xét nghiệm được thiết kế theo một danh mục bệnh cố định. Về bản chất đây là xét nghiệm được thiết kế riêng cho từng gia đình dựa trên biến thể gây bệnh đã được xác định, kiểu di truyền của bệnh lý cũng như thông tin di truyền liên kết trong gia đình đó.
Vì vậy là danh sách bệnh này chỉ mang tính chất minh họa cho các nhóm bệnh và tổn thương đã từng được triển khai tại Genome. Trên thực tế, xét nghiệm có thể được xây dựng cho nhiều bệnh lý đơn gen khác nhau bao gồm các biến thể điểm, mất đoạn, lặp đoạn hoặc các dạng tổn thương di truyền đặc thù khác trên cơ sở chuyên môn để thiết lập được quy trình phân tích cho gia đình và sẽ không thể giới hạn ở trên các cái danh sách gen như có trên slide.
=> Tham khảo thêm về các bệnh lý đơn gen mà PGT-M Genome có thể thực hiện!
=> Kết luận:
>> PGT-M không chỉ 1 xét nghiệm di truyền tiền làm tổ trên phôi mà là một quy trình phối hợp chặt chẽ giữa hỗ trợ sinh sản, di chuyển học phân tử và tư vấn di truyền. Việc xây dựng xét nghiệm riêng cho từng gia đình và kết hợp phân tích trực tiếp biến thể của toán di truyền liên kết sẽ giúp nâng cao độ tin cậy trong quá trình lựa chọn phôi và hỗ trợ giảm nguy cơ sinh con mắc bệnh di truyền đơn gen.
Genome cam kết đồng hành cùng các bác sĩ và gia đình trong toàn bộ quá trình từ tư vấn thiết lập xét nghiệm đến phân tích và trả kết quả cũng như là tư vấn di truyền sau xét nghiệm nhằm mang đến một giải pháp toàn diện chính xác và hiệu quả..