Tài liệu cung cấp các khuyến cáo về khía cạnh kỹ thuật của PGT đối với các bất thường đơn gen (PGT-M), bao gồm các phương pháp cơ bản và chiến lược xét nghiệm PGT-M. Ngoài ra, một số khuyến cáo cụ thể cũng được xây dựng cho các trường hợp đặc biệt
Nội dung đầy đủ của tài liệu vui lòng xem TẠI ĐÂY |
Tóm tắt nội dung tài liệu: ESHRE PGT Consortium good practice recommendations for the detection of monogenic disorders
Tóm tắt (adstract)
Lĩnh vực xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (PGT) đang phát triển nhanh chóng và các hướng dẫn thực hành tốt là vô cùng thiết yếu cho việc quản lý và chuẩn hóa các xét nghiệm chẩn đoán. Các hướng dẫn trước đây của ESHRE về thực hành tốt cho PGD (xuất bản năm 2005 và 2011) hiện được coi là đã lỗi thời; do đó, việc xây dựng các tài liệu mới đưa ra khuyến cáo thực hành tốt trong PGT là rất cần thiết. Tài liệu hiện tại cung cấp các khuyến cáo về khía cạnh kỹ thuật của PGT đối với các bất thường đơn gen (PGT-M), bao gồm các phương pháp cơ bản và chiến lược xét nghiệm PGT-M. Ngoài ra, một số khuyến cáo cụ thể cũng được xây dựng cho các trường hợp đặc biệt, bao gồm các biến thể bệnh lý phát sinh mới (de novo), các cặp vợ chồng cận huyết, định tuýp HLA, xét nghiệm loại trừ và các rối loạn do biến thể bệnh lý trong DNA ty thể (mtDNA) gây ra.
Ý nghĩa đối với bệnh nhân
- Tài liệu này mô tả các khuyến cáo thực hành tốt cho xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (PGT). Các tài liệu tương tự từng được xuất bản vào năm 2011, nhưng cần được cập nhật theo các kỹ thuật mới đang sử dụng tại các phòng lab IVF và di truyền hiện nay.
- Các khuyến cáo này nhằm giúp nhân viên phòng thí nghiệm và các chuyên gia di truyền thực hiện PGT theo quy trình lâm sàng và xét nghiệm tốt nhất có thể.
- Tài liệu này cung cấp các khuyến cáo về xét nghiệm di truyền cho các bệnh đơn gen – là những bệnh gây ra bởi sự thay đổi ở một trong các gen (và vị trí xảy ra sự thay đổi này trong gen đã được xác định rõ). Mục tiêu của xét nghiệm di truyền là lựa chọn một phôi không mang gen bệnh để chuyển lại vào tử cung người mẹ.
- Các khuyến cáo kỹ thuật này không liên quan trực tiếp đến bệnh nhân, nhưng chúng đảm bảo rằng bệnh nhân làm PGT sẽ nhận được sự chăm sóc tốt nhất có thể.
Mở đầu
Các thuật ngữ trước đây là chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD) và sàng lọc di truyền tiền làm tổ (PGS) đã được thay thế bằng thuật ngữ chung là xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (PGT), theo bản sửa đổi thuật ngữ trong chăm sóc vô sinh (Zegers-Hochschild và cộng sự, 2017).
PGT được định nghĩa là một xét nghiệm được thực hiện để phân tích DNA từ noãn bào (thể cực) hoặc phôi (giai đoạn phôi phân cắt hoặc phôi nang) nhằm định tuýp HLA hoặc xác định các bất thường về di truyền. PGT bao gồm:
- PGT-A: PGT phát hiện lệch bội.
- PGT-M: PGT đối với các bất thường đơn gen.
- PGT-SR: PGT đối với các tái cấu trúc cấu trúc nhiễm sắc thể.
PGT bắt đầu như một quy trình thử nghiệm vào những năm 1990 với các phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang liên pha (FISH) được giới thiệu vài năm sau đó và trở thành phương pháp tiêu chuẩn để xác định giới tính phôi cũng như phát hiện các bất thường số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể. Trong thập kỷ qua, các công nghệ giải trình tự trên toàn bộ bộ gen dần thay thế các phương pháp tiêu chuẩn vàng là FISH và PCR, xu hướng này rõ rệt nhất ở PGT-A.
Mục tiêu của chuỗi tài liệu này là đưa ra các thực hành tốt nhất cần tuân thủ trong tất cả các loại hình dịch vụ PGT (cung cấp cả PGT-A, PGT-M và PGT-SR).
Giới thiệu về PGT-M
PGT-M đề cập đến việc xét nghiệm các biến thể bệnh lý DNA trong nhân gây ra các rối loạn đơn gen, với các kiểu di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, lặn trên nhiễm sắc thể thường hoặc liên kết nhiễm sắc thể X, và cả các biến thể bệnh lý DNA ty thể (mtDNA). Nó cũng bao gồm xét nghiệm loại trừ và định tuýp HLA có hoặc không kèm theo xét nghiệm bệnh đơn gen đồng thời.
Một trong những thách thức lớn nhất đối với PGT-M là lượng DNA đầu vào rất ít, đòi hỏi các kỹ thuật khuếch đại DNA có độ nhạy cao. Các tế bào đơn lẻ được sinh thiết (thể cực hoặc một tế bào phôi) hoặc một vài tế bào (từ 5–10 tế bào lá nuôi phôi – TE) sẽ trải qua quá trình khuếch đại đích qua phản ứng Multiplex PCR hoặc bước khuếch đại toàn bộ bộ gen (WGA), sau đó là các ứng dụng hạ nguồn như PCR, chip đa hình đơn nucleotide (SNP array) hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS) (Hình 2).
Nguyên lý của hầu hết các phương pháp này dựa trên xác định haplotype (haplotyping) (tức là xác định nhóm các alen trong một đoạn di truyền trên một nhiễm sắc thể duy nhất được di truyền cùng nhau). Do đó, các marker di truyền nằm gần gen mục tiêu sẽ được định tuýp trong các mẫu DNA của cặp vợ chồng và các thành viên có liên quan trong gia đình đã biết trạng thái di truyền trong quá trình chuẩn bị tiền lâm sàng. Haplotype đi kèm với biến thể bệnh lý trong gia đình được gọi là haplotype nguy cơ cao (hoặc đột biến), trong khi haplotype không mang biến thể bệnh lý gia đình được gọi là kiểu dại (wild-type) hoặc haplotype nguy cơ thấp.
Xét nghiệm lâm sàng có thể là trực tiếp (khi biến thể bệnh lý kết hợp với các marker di truyền liên kết cùng được đánh giá) hoặc gián tiếp (khi xét nghiệm chỉ dựa trên phân tích haplotype).
Hạn chế của lượng DNA thấp liên quan đến việc tăng nguy cơ thất bại khuếch đại DNA (AF), nhiễm tạp DNA hoặc hiện tượng mất alen (allele drop-out – ADO), trong đó một trong hai alen trong một mẫu dị hợp tử được khuếch đại trong khi alen còn lại không được phát hiện. Điều này thường thách thức hơn đối với phân tích đơn bào so với phân tích một vài tế bào.
Khuyến cáo về chiến lược xét nghiệm và phát triển xét nghiệm
Ba chiến lược xét nghiệm chính cho PGT-M lâm sàng hiện nay bao gồm:
- Khuếch đại đích các marker di truyền có thông tin (informative markers) có hoặc không kèm theo biến thể bệnh lý bằng Multiplex PCR đơn bào/ít tế bào.
- Khuếch đại toàn bộ bộ gen (WGA) sau đó khuếch đại đích các marker di truyền có thông tin có hoặc không kèm theo biến thể bệnh lý.
- WGA kết hợp với một phương pháp tổng quan (generic method) như SNP array hoặc giải trình tự dựa trên NGS.
Một số khuyến cáo kỹ thuật đối với khuếch đại đích (Targeted Amplification) cho PGT-M:
- Các đoạn khuếch đại (amplicons) lý tưởng nên có kích thước từ 100 đến 500 bp, sử dụng tổ hợp các chất nhuộm huỳnh quang cho phép phân biệt các locus.
- Phản ứng Multiplex PCR một vòng (single-round) được ưu tiên hơn so với PCR tổ (nested PCR) hoặc bán tổ (semi-nested PCR) vì nó ít xảy ra sai sót hơn.
- Khi có thể, nên ưu tiên sử dụng các marker STR (lặp lại trình tự ngắn liên tiếp) với các đoạn lặp bộ 3, bộ 4 hoặc bộ 5 (tri-, tetra-, penta-nucleotide) nhằm giảm hiện tượng tạo vạch nhiễu (stutter patterns) và cải thiện khả năng phân biệt alen.
- Khi sử dụng các marker ngoài gen (extragenic markers), khuyến cáo nên chọn các marker nằm trong khoảng cách cách biến thể bệnh lý mục tiêu dưới 1-Mb (~1 cM) để giảm nguy cơ chẩn đoán sai do hiện tượng tái tổ hợp (recombination).
Thẩm định trước xét nghiệm cho PGT-M
- Các tiêu chí thẩm định phụ thuộc vào số lượng tế bào được sinh thiết và loại chiến lược được sử dụng cho PGT-M.
- Đối với xét nghiệm dựa trên STR đích và phân tích biến thể (có hoặc không có WGA trước đó), các tiêu chí sau được áp dụng:
- Độ chính xác (Accuracy): Phải đạt >99% đối với các mẫu đơn bào hoặc ít tế bào đã biết trước kiểu gen.
- Hiệu suất khuếch đại (Amplification efficiency): Mỗi locus phải đạt >95%. Hiệu suất >90% có thể chấp nhận được nhưng cần bổ sung thêm nhiều marker hơn.
- Tỷ lệ mất alen (ADO rate): Mỗi locus phải đạt <5%. Tỷ lệ ADO dưới 10% có thể chấp nhận được nhưng cần phải bổ sung thêm nhiều marker hơn.
- Đối với các chiến lược tổng quan như SNP array có WGA trước đó:
- Ngay cả khi sử dụng các quy trình thương mại đã được nhà sản xuất thẩm định, trung tâm vẫn được khuyến cáo thực hiện thẩm định triển khai thực tế (implementation validation) cho toàn bộ quy trình wet-lab và dry-lab trước khi áp dụng vào lâm sàng.
- Thử nghiệm thẩm định nên được thực hiện với tối thiểu 50 mẫu WGA, lý tưởng là bao quát nhiều chỉ định khác nhau.
- Độ chính xác phải đạt >99% đối với các mẫu WGA từ đơn bào hoặc ít tế bào đã biết trước kiểu gen.
Các xét nghiệm cho bệnh đơn gen đang triển khai tại Genome
Bài báo cáo của PGS.TS.BS Đặng Tiến Trường
Hội nghị khoa học thường niên của Hội Hỗ trợ sinh sản thành phố Hà Nội năm 2022, TS.BS. Đặng Tiến Trường trình bày bài báo cáo: Xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi bệnh đơn gen: xác định trực tiếp đột biên và phân tích di truyền liên kết.
Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ cho bệnh lý đơn gen (PGT-M)
– Cá thể hóa cho từng gia đình và có thể được tiến hành cho hầu hết các bệnh lý đơn gen.
– Sử dụng công nghệ MDA được sử dụng để khuếch đại WGA với độ chính xác cao nhất, độ bao phủ và độ tin cậy tốt hơn.
– Được kết hợp 2 phương pháp
- Chẩn đoán trực tiếp: giải trình tự Sanger, mini sequencing…
- Chẩn đoán gián tiếp: phân tích liên kết gen thông qua các chỉ thị di truyền như đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) hoặc các trình tự lặp ngắn (Short Tandom Repeat-STR).
- Sự kết hợp này được coi là tiêu chuẩn vàng trong xét nghiệm trước làm tổ bệnh đơn gen với độ chính xác cao nhất, giúp kiểm soát hiện tượng ADO và ngoại nhiễm, qua đó tránh chẩn đoán sai (Theo ESRHE, 2020) (1).
– Chuyên gia di truyền hàng đầu đồng hành giúp giải thích kết quả và hỗ trợ quá trình tư vấn di truyền.
PGT-Total: xét nghiệm cho bệnh đơn gen và tích hợp phân tích nhiều bất thường khác của phôi
Công nghệ:
PGT Total ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới kết hợp với phân tích các điểm đa hình đơn Nucleotide (SNPs) để xác định bộ haplotype dựa trên các vùng khác nhau của nhiễm sắc thể (NST).
Đa hình đơn Nucleotide (NSP) là sự khác nhau giữa các nucleotide đơn ở cùng một vị trí trên hệ gen giữa các cá thể. Các SNPs có thể phân bổ trên khắp các hệ gen, đại diện cho sự khác nhau giữa các cá thể.
Công nghệ SNP kết hợp công nghệ tin sinh đột phá giúp cho các xét nghiệm PGT-Total có thể phát hiện đồng thời các bất thường ở cả mức độ nhiễm sắc thể và mức độ gen trong cùng một lần chạy. Đảm bảo tuân thủ các hướng dẫn của Hiệp hội Sinh sản và Phôi học Châu Âu (ESHRE) trong xét nghiệm PGT.
Phạm vi: PGT-Total Xét nghiệm tích hợp PGT-A Expand/ PGT-SR*/ PGT-M/ PGT-HLA với phạm vi sàng lọc mở rộng, toàn diện với:
PGT-A Expand:
– Phát hiện bất thường lệch bội ở 24 NST
– Phát hiện bất thường cấu trúc NST (mất/lặp đoạn) >4Mb
– Phát hiện mức bội thể (đơn bội, đa bội)
– Phân tích tình trạng mất tính dị hợp tử (UPD/ROH)
– Phát hiện 6 vi mất đoạn có kích thước >1mb
– Phát hiện các nhóm ngoại nhiễm
PGT-SR*
– Bất thường cân bằng cấu trúc NST: Đảo đoạn, Chuyển đoạn (Chuyển đoạn tương hỗ, chuyển đoạn hòa hợp tâm);
– Bất thường không cân bằng cấu trúc NST: Chèn đoạn, mất đoạn
PGT-M
Phân tích các tổn thương gây bệnh (trực tiếp) và bộ Haplitype (SNP) liên kết với tổn thương gián tiếp (PGT-M trong PGT-Total có thể xác định nhiều tổn thương 1 lúc)
PGT-HLA
Xác định tương hợp hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (HLA). Cho phép lựa chọn phôi phù hợp HLA với những người thân, anh chị bị bệnh từ đó giúp thu thập tế bào gốc phục vụ điều trị.