Nguyên lý của ddPCR
PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR: droplet digital PCR) là phương pháp PCR sử dụng công nghệ vi giọt nhũ tương dầu-nước (water-oil emulsion droplet). Các phân tử DNA khuôn sẽ được chia nhỏ vào các vi giọt và phản ứng khuếch đại DNA sẽ diễn ra bên trong mỗi giọt. Các giọt về cơ bản có chức năng như các ống PCR riêng lẻ, mặc dù ở định dạng nhỏ hơn nhiều. Việc phân vùng này là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật ddPCR cho phép đo lường hàng nghìn sự kiện khuếch đại xảy ra độc lập trong cùng một mẫu.
Trong khi PCR truyền thống chỉ cung cấp một phản ứng PCR trong một ống, ddPCR sử dụng công nghệ vi lỏng (microfluidics) tiên tiến để phân chia một mẫu đơn thành khoảng 20.000 giọt đồng nhất với kích thước nano lít cho phép hàng nghìn phản ứng PCR cùng diễn ra trong một ống. Mỗi giọt sau đó được phân tích sự có mặt của tín hiệu huỳnh quang liên quan đến trình tự đích.
Ứng dụng của ddPCR
– Phát hiện đột biến gen liên quan đến ung thư: Phát hiện các đột biến gen liên quan đến nguyên nhân hình thành khối u đồng thời phát hiện những đột biến giúp gia tăng độ nhạy cảm với các thuốc điều trị đích.
– Theo dõi và kiểm soát bệnh: ddPCR có thể phát hiện các đột biến hoặc các tế bào ung thư tồn tại trong hệ tuần hoàn. Qua đó theo dõi sự thay đổi các đột biến kháng thuốc trong quá trình điều trị ung thư, xác định sự thay đổi của tỷ lệ đột biến đó trong máu trong quá trình điều trị giúp theo dõi và kiểm soát sự tiến triển của bệnh.
– Xác định biểu hiện gen và phân tích miRNA trong một số bệnh lý trong đó có ung thư: dPCR được sử dụng trong xét nghiệm phân tích biểu hiện gen, đặc biệt với những mẫu khó như tế bào đơn (single cell) hoặc mẫu mô đúc trong paraffin (FFPE).
– Chẩn đoán di truyền không xâm lấn bằng máu mẹ (NIPT)
Quy trình PCR vi giọt kỹ thuật
Bước 1: Đầu tiên, phản ứng PCR được chuẩn bị tương tự như phản ứng real-time PCR sử dụng đầu dò Taqman có gắn các huỳnh quang báo cáo FAM, HEX hoặc VIC, hoặc các chất phát quang bám DNA mạch đôi như EvaGreen. Phản ứng cũng bao gồm các thành phần cơ bản như mẫu DNA, mồi, đầu dò, Taq polymerase, dNTP, Mg… trong tổng thể tích 20µl.
Bước 2: Mẫu được đặt trong máy tạo vi giọt để phân vùng mẫu vào khoảng 20,000 giọt có kích thước nanolit. Các giọt được tạo thành có kích thước và thể tích giống nhau, chứa đầy đủ các thành phần của một phản ứng real-time PCR. Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt này.
Bước 3: Tiếp theo là quá trình khuếch đại DNA trong các vi giọt sử dụng máy PCR luân nhiệt thông thường. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra sẽ tích lũy trong từng vi giọt, phụ thuộc vào số lượng DNA đích phân bố trong đó.
Bước 4: Sau khi quá trình PCR kết thúc, mẫu sẽ được chuyển vào máy đọc tín hiệu để phân tích cường độ tín hiệu huỳnh quang trong mỗi vi giọt sử dụng hệ thống phát hiện hai màu FAM và HEX hoặc VIC cho phép phân tích đồng thời các DNA đích khác nhau trong cùng một mẫu.
Bước 5: Cuối cùng là phân tích dữ liệu. Các giọt dương tính chứa ít nhất một bản copy của DNA đích sẽ có tín hiệu huỳnh quang cao hơn so với các giọt âm tính. Tỷ lệ của các giọt dương tính sau đó sẽ được áp dụng mô hình phân phối Poisson để xác định số lượng tuyệt đối của DNA đích trong phản ứng ban đầu theo đơn vị copies/ µl.
Ưu điểm của công nghệ ddPCR
| δ
Phát hiện trình tự với hàm lượng thấp |
φ
Cho phép phát hiện sự khác biệt rất nhỏ trong số bản sao |
◊
Cho phép định lượng tuyệt đối |
θ
Độ lặp lại và độ nhạy cao với mẫu nồng độ thấp |
Trung tâm xét nghiệm Genome
Genome đầu tư rất lớn vào Trung tâm xét nghiệm nhằm xây dựng cơ sở hạ tầng đồng bộ toàn diện, được trang bị hiện đại đạt chuẩn quốc tế. Chúng tôi ứng dụng công nghệ 4.0 trong thu mẫu, quản lý xét nghiệm, trả kết quả, nhằm hạn chế sai sót do con người. Mục tiêu của Genome là cung cấp xét nghiệm hiện đại, phục vụ tận tâm bệnh nhân và bác sĩ.
Xem thêm
Đội ngũ chuyên gia
Xét nghiệm ung thư trên mẫu sinh thiết lỏng
Xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn E-NIPT
Xét nghiệm phát hiện nguy cơ ung thư – CANcerNext Risk